结核分枝杆菌复合群核酸检测试剂注册技术审查指导原则\t（一）
2015/9/27 弗锐达医疗器械资讯
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来源：CFDA
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本指导原则旨在指导注册申请人对结核分枝杆菌复合群核酸检测试剂注册申报资料的准备及撰写，同时也为技术审评部门审评注册申报资料提供参考。
本指导原则是对结核分枝杆菌复合群核酸检测试剂的一般要求，申请人应依据产品的具体特性确定其中内容是否适用，若不适用，需具体阐述理由及相应的科学依据，并依据产品的具体特性对注册申报资料的内容进行充实和细化。
本指导原则是供申请人和审查人员使用的指导文件，不涉及注册审批等行政事项，亦不作为法规强制执行，如有能够满足法规要求的其他方法，也可以采用，但应提供详细的研究资料和验证资料。应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。
本指导原则是在现行法规、标准体系及当前认知水平下制定的，随着法规、标准的不断完善和科学技术的不断发展，本指导原则相关内容也将适时进行调整。
一范围
结核病是由结核分枝杆菌、牛结核分枝杆菌和非洲分枝杆菌等引起的慢性传染性疾病，可累及全身各个器官，以肺结核最为多见。其中，结核病的病原菌主要是结核分枝杆菌，牛结核分枝杆菌次之。结核分枝杆菌主要是经空气传播，大多数人在感染结核分枝杆菌后并无症状，称为潜伏感染。潜伏感染可持续几十年，仅有5%—10%的潜伏感染者发展为活动性肺结核。
在结核病的细菌学检验中，通常将分枝杆菌分为结核分枝杆菌复合群(Mycobacterium tuberculosis complex)和非结核分枝杆菌(Nontuberculosis mycobacteria, NTM)。结核分枝杆菌复合群包括结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、牛结核分枝杆菌(M.bovis)、非洲分枝杆菌(M.africanum)和田鼠分枝杆菌(M.microti)。在结核分枝杆菌复合群内各种中，除田鼠分枝杆菌对人无致病力外，其他三种菌均可对人致病，产生大致相同的临床表现。因此，临床上往往只做结核分枝杆菌复合群的鉴定而不进行亚种水平的鉴定，用于结核辅助诊断的核酸检测试剂也常采用结核分枝杆菌复合群共有的核酸序列作为靶标来进行检测。
核酸检测是肺结核病原学诊断的重要参考。2009年，美国疾病控制预防中心(CDC)更新了肺结核的诊疗指南，将核酸检测作为肺结核的辅助诊断方法，明确：对所有疑似肺结核患者，应至少进行一个呼吸道样本的核酸检测。我国《临床诊疗指南—结核病分册》也明确：结核分枝杆菌的DNA检测可作为肺结核诊断的参考。
与其他实验室检查方法比较，核酸检测的价值在于：
(1)可快速鉴别结核分枝杆菌复合群与非结核分枝杆菌，提高涂片阳性肺结核的诊断特异性；
(2)与涂片比较，灵敏度较高，可提高涂片阴性肺结核的检出率；
(3)与培养相比，操作快速，可及早进行正确的医疗处置。
结核分枝杆菌复合群核酸检测试剂是指：利用分子生物学检测技术，如聚合酶链式反应(PCR)等，以特定的结核分枝杆菌复合群共有的核酸序列为检测靶标，对痰、支气管肺泡灌洗液中的结核分枝杆菌复合群进行体外定性检测的试剂，用于肺结核的辅助诊断。
本指导原则的技术要求是基于荧光探针PCR方法建立的，对于其他分子生物学检测技术，可能部分要求不完全适用或本文所述技术指标不够全面，申请人可以根据产品特性对不适用部分进行修订或补充其他的评价和验证，但需阐述不适用的理由，并验证替代方法的科学合理性。
本指导原则适用于以结核分枝杆菌复合群共有的靶核酸序列作为靶标进行检测的试剂，对于某些以结核分枝杆菌特有的靶核酸序列为靶标进行检测的试剂，可能部分要求不完全适用或本文所述技术指标不够全面，申请人可以根据产品特性对不适用部分进行修订或补充其他的评价和验证，但需阐述不适用的理由，并验证替代方法的科学合理性。
本指导原则适用于预期用途为肺结核辅助诊断的、以痰或支气管肺泡灌洗液作为适用样本类型的结核分枝杆菌复合群核酸检测试剂。对于用途相同的其他呼吸道样本类型，或者预期用途为肺外结核辅助诊断的结核分枝杆菌复合群核酸检测试剂，可能部分要求不完全适用或本文所述技术指标不够全面，申请人可以根据产品特性对不适用部分进行修订或补充其他的评价和验证。
本指导原则适用于进行首次注册申报和相关许可事项变更的产品。
二主要生产工艺介绍，可以图表方式表示。
2.反应原理介绍。
3.基因序列的选择、PCR方法学特性介绍。
4.核酸提取/纯化方法确定的研究资料。
5.确定最佳PCR反应体系的研究资料，包括酶浓度、引物/探针浓度、dNTP浓度、阳离子浓度、样本量及反应体积等。
6.确定PCR反应各阶段温度、时间及循环数的研究资料。
7.对于基线阈值(threshold)和阈值循环数(Ct)确定的研究资料。
(四)分析性能评估资料
企业应提交在产品研制阶段对申报试剂进行的所有性能验证的研究资料，包括具体的试验方法(操作步骤)、内控标准、实验数据、统计分析等详细资料。对于结核分枝杆菌复合群核酸定性检测试剂，建议着重对以下分析性能进行研究。
1.最低检测限(分析灵敏度)
1.1最低检测限的确定
建议使用结核分枝杆菌标准菌株、牛结核分枝杆菌标准菌株或BCG标准菌株(如适用)的梯度稀释液来确定最低检测限。每个梯度进行不少于20次的重复检测，将具有95%阳性检出率的菌株浓度作为最低检测限。应明确每份菌株的来源、基因型特性、浓度、制备方法等信息。企业可采用铺板计数细菌集落形成单位(colony forming unit，CFU)的方法进行菌株浓度的确认，以CFU/mL作为菌株浓度的表示方式；也可采用国家参考品对菌株浓度进行标定，以“个菌/mL”作为菌株浓度的表示方式。
为确定痰样本的最低检测限，建议将已知浓度的菌株与结核分枝杆菌复合群阴性的痰样本进行混合，完全按照申报试剂的操作步骤对此“制备痰液”进行样本前处理、核酸提取/纯化、扩增等。对结核分枝杆菌复合群阴性痰样本的确认，应采用涂片、培养鉴定、临床诊断和其他已上市的核酸检测试剂盒进行联合确认。最低检测限的浓度应是“制备痰液”的最终菌株浓度。
1.2最低检测限的验证
应在最低检测限的菌株浓度对结核分枝杆菌、牛结核分枝杆菌或BCG菌株(如适用)进行至少20次的重复试验验证，每种菌株的阳性检出率为95%。企业应能够提供用于最低检测限验证的各个菌株的来源、制备方法及浓度等信息。“最低检测限的验证”的试验方法可参考“最低检测限的确定”。
2.分析特异性
2.1交叉反应
用于结核分枝杆菌复合群核酸检测试剂交叉反应验证的病原体种类主要考虑以下几方面：核酸序列具有同源性、易引起相同或相似的临床症状、采样部位正常寄生或易并发的其他病原体。主要包括：非结核分枝杆菌复合群(NTM)、常见的口腔和呼吸道共生的病原体等，具体目录参见表1和表2。
建议在病原体感染的医学相关水平进行交叉反应的验证。建议进行交叉反应验证的分枝杆菌、细菌或者真菌的最低浓度为106 CFU/mL；进行交叉反应验证的病毒的最低浓度为105 PFU/mL(plaque forming unit，PFU，空斑形成单位)。应提供用于交叉反应验证的病原体的制备方法、来源、种属和浓度等信息。
对于某些难以培养或者因为生物安全性无法培养的病原体，可采用病原体核酸样本进行交叉反应的验证。应提供用于交叉反应验证的病原体核酸的来源、组成和浓度等信息。采用病原体核酸样本进行试验时，应将核酸样本视为实际使用过程中参与PCR反应的核酸样本，根据试剂说明书的要求配制PCR反应体系，进行扩增。
有关交叉反应验证的信息应以列表的方式在产品说明书的【产品性能指标】项中体现。
表1 用于交叉反应研究的其他分枝杆菌
(非结核分枝杆菌复合群的其他分枝杆菌)
堪萨斯分枝杆菌
苏加分枝杆菌
海分枝杆菌
龟分枝杆菌
土地分枝杆菌
偶发分枝杆菌
次要分枝杆菌
耻垢分枝杆菌
溃疡分枝杆菌
脓肿分枝杆菌
戈登分枝杆菌
胃分枝杆菌
蟾蜍分枝杆菌
胞内分枝杆菌
鸟分枝杆菌
草分枝杆菌
瘰疬分枝杆菌
注:表中所列细菌均应进行验证。
表2 用于交叉反应研究的其他病原体
肺炎链球菌
金黄色葡萄球菌
流感嗜血杆菌
诺卡氏菌
大肠杆菌
绿脓杆菌
表皮葡萄球菌
白色念珠菌
隐球菌
人类副流感病毒(1、2和3型)
人流感病毒(A型和B型)
注:表中所列病原体均应进行验证。
2.2干扰物质
潜在的干扰物质主要包括：内源性物质(如血液、粘液、人细胞等)和外源性药物。
建议使用医学相关水平的干扰物浓度进行验证，另外，建议申请人在每种干扰物质的潜在最大浓度(最差条件)条件下进行评价。对于常见药物干扰试验，建议参照相应药物药代动力学研究确定的治疗药物浓度添加相应药物进行干扰验证。
表3 用于干扰研究的外源性药物
异烟肼
乙胺丁醇
利福平
吡嗪酰胺
卡那霉素
链霉素
抗生素(如：阿莫西林、左氧氟沙星)
抗病毒药(如：扎那米韦)
鼻腔喷雾剂或滴鼻剂(如：肾上腺素、羟甲唑啉、含防腐剂的氯化钠溶液)
鼻腔糖皮质激素(如：倍氯米松、地塞米松、氟尼缩松、曲安西龙、布地奈德、莫美他松、氟替卡松)
鼻用软膏类(如：莫匹罗星)
注: 表中所列外源性药物均应进行验证，括号内至少选做一种。
3.精密度
测量精密度的评价方法并无统一的标准可依，可根据不同产品特征或企业的研究习惯进行，前提是必须保证研究的科学合理性。具体实验方法可以参考国内或国外的相关文件进行。企业应对每项精密度指标的评价标准做出合理要求，如标准差或变异系数的范围等。针对申报试剂的精密度评价主要包括以下要求。
3.1对可能影响检测精密度的主要变量进行验证，除申报试剂(包括提取/纯化组分和PCR组分)本身的影响外，还应对不同的适用机型(如PCR分析仪)、操作者、地点等要素进行相关的验证。
3.2合理的精密度评价周期，例如：为期至少12天的检测，每天至少由2人完成不少于2次的完整检测，从而对批内/批间、日内/日间以及不同操作者之间的精密度进行综合评价。如有条件，申请人应选择不同的实验室进行重复实验以对室间精密度进行评价。
3.3建议采用结核分枝杆菌标准菌株(“3.3.1阴性样本”不适用)作为样本，在以下3个浓度水平进行验证：
3.3.1阴性样本：不含结核分枝杆菌标准菌株的样本，阴性检出率应为100%(n≥20)。
3.3.2弱阳性样本：结核分枝杆菌标准菌株浓度略高于试剂盒的最低检测限，阳性检出率应高于95%(n≥20)。
3.3.3中等阳性样本：结核分枝杆菌标准菌株浓度约为最低检测限的2倍或3倍，阳性检出率为100%且CV≤15%(n≥20)。
4.反应性(包容性)
应证明申报试剂可以检测代表不同基因多态性的结核分枝杆菌复合群菌株。应至少对结核分枝杆菌、牛结核分枝杆菌或BCG菌株(如适用)、非洲分枝杆菌和田鼠分枝杆菌进行验证。应采用略高于最低检测限浓度的结核分枝杆菌复合群菌株进行研究。应提供各个菌株的来源、菌株特性及浓度等信息。应证明所有采用的菌株含有靶核酸序列。
5.不同样本类型、样本前处理方法、核酸提取/纯化方法的分析性能资料要求
由于痰和支气管肺泡灌洗液样本之间差异较大，如申报试剂同时包括这两种样本类型，申请人应提交每种样本类型的全项目分析性能评估资料。
对于每种样本类型而言，申请人应提交适用的样本前处理方法(进行全项目分析性能评估的样本前处理方法除外)与后续试验配合进行的性能试验(至少包括最低检测限项目)，以证明不同的样本前处理方法不会影响检测结果。
对于每种样本类型而言，申请人应提供适用的核酸提取/纯化方法(进行全项目分析性能评估的核酸提取/纯化方法除外)与后续试验配合进行的性能试验(至少包括最低检测限和精密性项目)，以证明不同的核酸提取/纯化方法不会影响检测结果。
如果申报试剂同时适用于几种不同的临床样本类型、样本前处理方法和核酸提取/纯化方法，每种样本类型应明确其适用的样本前处理方法(一种或几种)和核酸提取/纯化方法(一种或几种)。如果申报试剂最终仅保留某种样本类型、某种样本前处理方法和某种核酸提取/纯化方法，分析性能评估资料应采用该组合进行。
6.注意事项
对于适用多个机型的产品，应提供如产品说明书【适用仪器】项中所列的所有型号仪器的至少三批全性能评估资料。
(五)阳性判断值确定资料
对于此类试剂，阳性判断值确定资料主要是指Ct值的确认资料，建议申请人采用受试者工作特征(ROC)曲线的方式确定申报试剂用于结果判断的临界值。有关ROC曲线分析的细节，请参考国内外相关的文件。如存在灰区，应提交灰区上下限确定的详细的研究资料。
(六)稳定性研究资料
稳定性研究资料主要涉及两部分内容，申报试剂的稳定性和适用样本的稳定性研究。前者主要包括实时稳定性(有效期)、运输稳定性、开封稳定性及冻融次数限制等研究，申请人可根据实际需要选择合理的稳定性研究方案。稳定性研究资料应包括研究方法的确定依据、具体的实施方案、详细的研究数据以及结论。对于实时稳定性研究，应提供至少三批样品在实际储存条件下保存至成品有效期后的研究资料。
申请人应对样本稳定性进行研究，主要包括冷藏和冷冻两种条件下的有效期验证，可以在合理的温度范围内选择3—5个温度点(应至少包括范围的上限和下限温度)，每间隔一定的时间段对储存样本进行分析性能验证，从而确认不同类型样本的效期稳定性。用于样本稳定性研究的样本应包括最低检测限浓度的样本。除了定性结果之外，还需要提供原始信号的分析，如Ct。适于冷冻保存的样本还应对冻融次数进行评价。
试剂稳定性和样本稳定性两部分内容的研究结果均应在说明书【储存条件及有效期】和【样本要求】两项中进行详细说明。
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